J Exp Med：烟酰胺单核苷酸转移酶（NNT）通过维持Fe-S蛋白功能而调节NSCLC肝细胞代谢

本能白血病表现出新强大而复杂的细胞内葡萄糖，显然是由肺组织的高氧官能遭受的。由于活官能氧(ROS)的生成是这种葡萄糖的副有机体，因此须要以烟酰胺N-二核苷硫磷硫(NADPH)的形式来减缓降解应激，以应对这种细胞内活官能的提升。烟酰胺单核苷硫甘氨酸(NNT)可通过NADPH的生成来保有细胞内的抗降解意志力，但其在非小巨噬细胞白血病(NSCLC)中都的起着尚未明确。本研究者注意到NNT的理解在白血病果蝇三维中都明显提升了的过渡到和首当其冲官能。另均，再进一步研究者注意到NNT不足之处就会导致细胞内功能官能障碍，这与降解应激的大量减缓无关，而是以铁硫受体的活官能减缓为标志。这些不足之处与NADPH的有效官能和ROS的依靠有关，这暗示NNT在减轻这些更为重要受体胺基酸的降解中都起着更为重要起着。

实验设计

许多常见的白血病果蝇三维是借助于C57BL6/J果蝇的饲养方式而而建立。奇怪的是，这些果蝇随身携带纯合均显子7-11的框内不足之处以及细胞内中都Nnt基因序列的错义变异导致非功能官能受体的理解。因此，可以借助于这种自然不足之处的等位基因(NntΔex7-11)来高度评价NNT对白血病再次发生的制约。

首先，使用Kras变异(LSL-KrasG12D/+)造成了的白血病三维来检测Nnt理解对白血病再次发生的制约。随身携带Cre拆分酵素的腺病毒受到感染LSL-KrasG12D/+果蝇，可抑止KrasG12D在肺上皮中都的理解和肺腺癌的过渡到。借助于LSL-KrasG12D/+果蝇和C57BL6/J果蝇交配转化成Nnt+/+理解果蝇或NntΔex7-11/Δex7-11理解果蝇(绘出新1A-1B)。该三维中都Nnt的理解导致Cre拆分酵素抑止的损耗加快3个同年(绘出新1C-1D)。然后，借助于Kras变异与p53不足之处同时理解(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也称为KP)建立白血病三维。Nnt的理解很难相反Cre抑止的KP果蝇的存活率(绘出新1E)。奇怪的是，在这个三维中都，p53的不足之处消除了Nnt理解对白血病过渡到的制约，并且无论Nnt理解如何，实验终究都存在明显的损耗(绘出新1F)。白血病损耗比例的量化在不尽相同表现型果蝇两者之间很难差异(绘出新1G-1H)。

虽然不尽相同表现型果蝇两者之间的损耗很难差异，但确实推论到三维中都首当其冲官能的差异。我们注意到Nnt+/+果蝇中都51.3%的为3级(腺癌)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11果蝇中都仅有36.5%和38.8%的是高级(绘出新1I)。Nnt+/+果蝇再次发生4级的kHz明显减缓，展示出首当其冲官能的波动(绘出新1J)。总之，这些数据集暗示Nnt推动了白血病的再次发生和首当其冲。

2 NNT的不足之处不制约细胞内中都硫氧还受体(TXN)的抗降解法制

为了再进一步评估NNT对白血病生物化学的制约，首先评估shRNA不良制约NNT受体的理解，包括4个理解NNT受体的NSCLC巨噬细胞系 (A549, H1299，H2009和PC9)和不理解NNT受体的H441巨噬细胞(绘出新2A)。不良制约NNT受体理解消除NSCLC巨噬细胞的增生意志力(绘出新2B)。并且注意到比较慢病毒受到感染4紧接著NNT的减至减缓了H2009和PC9巨噬细胞的机动力(绘出新2C)。此均，H441巨噬细胞的增生不受NNT的制约。

有时候确信NNT有效地NADPH的还原意志力，从而保有细胞内受体抗降解种系统处于还原静止状态(绘出新2D)。不良制约NNT减缓了H1299、H2009和PC9巨噬细胞中都NADPH: NADP+的比例 (绘出新2E)。比较慢病毒受到感染4紧接著细胞内中都H2O2明显减缓(绘出新2F)，所以NNT对H2O2消肿反复很最主要。

为了断定这些细胞内ROS的减缓到底与细胞内抗降解种系统有关，于是借助于Western blotting评估细胞内中都过降解物受体3(PRDX3)的降解静止状态。H2O2通过PRDX3消肿，即一对半胱氨硫二硫键抑止PRDX3过渡到二聚体，并且须要通过TXN还原这些半胱氨硫二硫键才能还原PRDX3的抗降解功能官能。PRDX3二聚体的依靠是PRDX3降解的标志，是细胞内降解应激的常见标志物。

奥拉诺芬是一种TXN还原酵素(TRXR)消除剂，虽然奥拉诺芬的疗程就会导致PRDX3受体大量降解，但NNT的不足之处并很难减缓PRDX3的降解(绘出新2G)。此均，NNT的不足之处也很难减缓细胞内TXN2或TRXR2的受体水平。总之，这些相比较NNT在NSCLC巨噬葡萄糖物意志力上发挥最主要起着，但NNT活官能的丧失并一定就会受到影响细胞内TXN抗降解种系统，也一定就会造成了明显的降解应激。

3 NNT的不足之处就会受到影响细胞内的降解意志力

鉴于NNT在IMM中都的有别于及其制约膜上质子通量和还原意志力，于是意绘出新探讨NNT对细胞内降解葡萄糖到底最主要。首先，使用海马巨噬细胞均通量分析仪顺利进行细胞内负面影响次测试，评估NNT不足之处对一般细胞内降解功能官能的制约。结果注意到NNT不足之处巨噬细胞的耗氧量(OCR) 随细胞内消除剂的依次传递而被减缓(绘出新3A)。值得注意的是，NNT不足之处巨噬细胞的较大颤动意志力在不依赖于非耦合颤动的意味著明显减缓(绘出新3B)。这提醒细胞内降解不足之处与NNT对质子通量的制约无关。鉴于NNT不足之处明显制约颤动意志力，于是检测NNT不足之处的H441巨噬细胞到底比NNT理解巨噬细胞具有更加少的降解和更加强的糖酵解意志力。这指明这些巨噬细胞在很难NNT的意味著显然通过细胞内NADPH是从而保有细胞内的功能官能。

细胞内的降解葡萄糖依赖于ETC的功能官能，ETC由抑止电子传递的Fe-S受体亚基都是由。考虑到Fe-S受体亚基的酪氨酸反复须要NADPH，于是研究者NNT不良制约后细胞内颤动功能官能的下降到底与Fe-S受体之外。细胞内负面影响次测试可以对颤动功能官能顺利进行一般官能的分析，但不可以对单个ETC亚基所含顺利进行评估。因此，写作者顺利进行了更加为专业的实验来分析Fe-S受体依赖的颤动之外亚基(I, II, III)。结果注意到，基于亚基I(硫和苹果硫)的营养，在NNT不良制约后亚基I-III的活官能明显减缓(绘出新3C)。此均，NNT不足之处巨噬细胞明显减缓了琥珀硫的OCR，暗示减缓了琥珀硫脱氢酵素(SDH)活官能和亚基II-III流速(绘出新3D)。导致这一现象的最主要原因是SDH在ETC和TCA循环中都扮演着双重角色。

除了通过ETC保有电子流速均，Fe-S受体还保有对降解葡萄糖至关最主要的其他受体酵素的功能官能。为了断定NNT到底参予其他Fe-S受体的功能官能，写作者评估了TCA循环中都Fe-S受体——顺大戟硫酵素(ACO2)的活官能。结果注意到不良制约NNT明显减缓了NSCLC巨噬细胞系中都ACO2的活官能(绘出新3E)。ACO2活官能的减缓显然就会摧毁TCA循环，进而减缓涡轮ETC流速的还原官能物质的生成。为了补充非小巨噬细胞白血病中都ACO2功能官能的分析，于是高度评价Nnt理解对KP白血病中都ACO2活官能的制约。相比较，Nnt+/+果蝇中都Aco2活官能明显高于NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11中都的，依赖于Nnt的表现出新最低的活官能(绘出新3F)。

4 均源官能NADPH在NNT不足之处后保有Fe-S受体功能官能

为了断定与不良制约NNT之外的细胞内Fe-S受体功能官能的减缓到底与NADPH:NADP+的减缓有关，我们意绘出新提供者一种细胞内NADPH的均源官能是从。为了发挥作用这一期望，我们选择了酵母细胞内中都NADH激酵素pos5p，它可以磷硫化NADH而转化成NADPH。虽然pos5p以前在细菌中都也有均源理解，但据我们所知，pos5p还很难被引入哺乳动物种系统。为了检测我们到底能够有效地在本能NSCLC巨噬细胞的细胞内中都理解pos5p受体，我们对酵母受体顺利进行了修饰，使其包含HA-tag。Western blot结果显示，在H1299、H2009和PC9巨噬细胞的细胞内中都尝试理解了HA-tag上面的pos5p受体(绘出新4A)。选择这些巨噬细胞系是为了评估pos5p修复和NNT不足之处之外的Fe-S受体不足之处的意志力，注意到不良制约NNT后对它们遭受很导致的制约。

pos5p的理解补救了巨噬细胞中都不良制约NNT后造成了的NADPH: NADP+比例的减缓(绘出新4B)。这与理解pos5p巨噬细胞中都pos5p扰后颤动核酸复杂文艺活动的减缓有关(绘出新4C和4D)。此均，pos5p的理解显然补救了NNT不良制约后ACO2活官能的下降(绘出新4E)。总之，这些数据集暗示保有NNT理解不足之处时NADPH的水平可以保护NSCLC巨噬细胞中都Fe-S受体的功能官能。

5 NNT的不足之处一定就会摧毁Fe-S受体的酪氨酸

考虑到细胞内均源官能NADPH能够逼近NNT不足之处之外Fe-S受体的不足之处，并且NADPH是高效保有Fe-S受体酪氨酸的必备条件，因此我们接下来意绘出新断定NNT活官能到底保有这一反复。Fe-S受体酪氨酸再次发生在一个由半胱氨硫高炉酵素(NFS1)和Fe-S支架受体(ISCU)都是由的多受体亚基中都。亚基中都任何一种所含的不足之处都就会制约酪氨酸，并且也与细胞内不足之处之外。因此，我们不良制约NFS1或ISCU理解来研究者摧毁Fe-S受体酪氨酸后对颤动核酸和ACO2的制约。

在H2009巨噬细胞中都，不良制约NFS1后明显减缓硫/苹果硫化学反应和琥珀硫化学反应中都颤动核酸亚基I-III的活官能，而在PC9巨噬细胞中都只有亚基II-III活官能被明显减缓(绘出新5A和5B)。另均，两个巨噬细胞系中都，在硫/苹果硫和琥珀硫的起着下，不良制约ISCU理解后明显逼近了OCR(绘出新5A和5B)。并且不良制约NFS1或ISCU后明显减缓了巨噬细胞系中都ACO2活官能(绘出新5C)。奇怪的是，NNT不良制约后所造成了的不足之处与Fe-S受体酪氨酸所均需物质遭受的不足之处是同等最主要的(绘出新5A-5C)。

为了证明了Fe-S受体不足之处对NSCLC巨噬细胞的细胞内葡萄糖有功能官能官能制约，我们对不良制约NNT或ISCU巨噬细胞顺利进行基于色谱小分子-高分辨质谱(LC-HRMS)的葡萄糖组学研究者。 对这些巨噬细胞TCA循环的葡萄糖物顺利进行分析，结果显示大多数中都间有机体的核素再次发生了明显波动(绘出新5D)。这些都暗示了降解葡萄糖的导致摧毁和Fe-S受体功能官能不足之处的一致官能。具体地说就是不良制约NNT和ISCU理解后，硫、苹果硫和富马硫被耗尽。NNT不足之处巨噬细胞中都的柠檬硫水平被耗尽掉，但不良制约ISCU巨噬细胞中都并很难此结果。另均，不良制约ISCU巨噬细胞中都琥珀硫大量依靠，而在NNT不足之处巨噬细胞中都则不存在此现象(绘出新5D)。

除了Fe-S受体ACO2和SDH均，TCA循环还依赖于另一种细胞内Fe-S受体——硫辛硫多肽酵素(LIAS)的功能官能。LIAS对于硫辛硫的多肽以及最主要硫辛硫盐基团的共轭都极为更为重要，硫辛硫盐基团由PDH (E2)和α-酮戊二硫脱氢酵素(二氢硫辛酰胺S-琥珀酰甘氨酸，DLST)都是由。LIAS对Fe-S受体酪氨酸的摧毁特别引人注目，因为其Fe-S簇在催化反复中都被耗尽掉，这就要求迅速地顺利进行受体交换。事实上，不良制约NFS1和ISCU理解就会大量减缓PC9巨噬细胞中都PDH-E2和DLST的脂化，然而不良制约NNT对受体脂化无制约(绘出新5E)。总的来说，这些数据集暗示，NNT造成了酵素和葡萄糖不足之处，它们的不足之处与Fe-S受体酪氨酸的摧毁之外，但NNT不显然直接制约这一反复。这凸显出新不良制约NNT和ISCU后对TCA循环转化成类似但又不尽相同的制约。

6 NNT的不足之处摧毁脂肪硫葡萄糖

除了耗尽TCA循环均，NNT不足之处巨噬细胞的LC-HRMS葡萄糖组学分析暗示脂肪硫葡萄糖失调。不良制约NNT推动长核酸脂肪酰基单糖的大量依靠，而长核酸脂肪酰基单糖是脂肪硫β-降解的底物(绘出新6A)。鉴于在NNT不足之处巨噬细胞中都存在颤动种系统不足之处，我们推测这些酰基单糖的减缓是由于脂肪硫降解减缓。我们注意到在H1299和PC9巨噬细胞中都OCR与橄榄硫盐的降解有关，不良制约NNT后OCR减缓(绘出新6B)。我们还推论到NNT不足之处巨噬细胞中都饱和脂肪硫和不饱和脂肪硫均大量依靠(绘出新6C)。脂肪硫多肽须要耗尽大量NADPH，而且NNT不良制约后NADPH的有效官能减缓，于是我们确信这些脂肪硫水平的减缓是由于均源官能脂肪硫摄入的减缓。另均，我们注意到，NNT不足之处巨噬细胞提升了对荧光橄榄硫衍生物的吸收意志力(绘出新6D)。为了高度评价NNT不良制约后脂肪硫的依靠断定一个潜在的不利因素，我们使用饱和脂肪硫橄榄硫酯刺激NNT不足之处巨噬细胞24小时，注意到NNT不良制约后使H1299和H2009巨噬细胞对橄榄硫盐引人注目(绘出新6E)。此均，NNT不良制约后明显提高了H1299和PC9巨噬细胞对单一不饱和脂肪硫油硫盐的引人注目度(绘出新6F)。鉴于均源官能脂肪硫补充的有毒气体制约，我们预计巨噬细胞均磷脂耗尽将保护NNT的不足之处。令人惊讶的是，培养基中都的磷脂耗尽助长了NNT的减至(绘出新6G)。更加最主要的是，NNT不良制约后巨噬细胞均磷脂缺少就会减缓NADPH的耗尽(绘出新6H)，这暗示在依赖于均源官能脂肪硫的意味著只好多肽脂肪硫，使NNT不足之处巨噬细胞中都NADPH的有效官能减缓。总的来说，这些数据集暗示NNT显然在缓冲脂肪硫葡萄糖中都起最主要起着，NSCLC巨噬细胞的脂肪硫葡萄糖紊乱显然是一个可借助于的弱点。

7 NNT不足之处后细胞内特异官能过降解氢酵素(MitoCatalase)补救Fe-S受体功能官能

Fe-S受体对分子氧和更加多有毒气体物质的降解极为引人注目。虽然我们很难推论到细胞内受体抗降解种系统的降解静止状态再次发生波动，但这并不排除NNT不良制约后造成了的细胞内ROS足够将这些引人注目度胺基酸降解。为了探究这种显然官能，我们使用了细胞内特异官能的过降解氢酵素(MitoCatalase)来提升细胞内的抗降解意志力。我们尝试地在H1299、H2009和PC9巨噬细胞中都过理解了MitoCatalase (绘出新7A)。MitoCatalase的理解也部分逼近了NNT不良制约后之外细胞内中都H2O2的转化成(绘出新7B)。这与NNT不良制约后颤动核酸复杂文艺活动的减缓比起应(绘出新7C和7D)。另均，MitoCatalase的理解恢复NNT不良制约后ACO2的活官能(绘出新7E)。综上所述，这些数据集暗示，提高细胞内消肿H2O2的意志力可以可避免NNT不良制约后Fe-S受体再次发生不足之处，从而使NNT在可避免Fe-S受体再次发生降解之外发挥起着，但对Fe-S簇的酪氨酸无起着。

论断

总之，我们的研究者暗示，NNT对白血病生物化学具有最主要意义，主要是通过调控Fe-S受体而推动细胞内葡萄糖。与以往高度评价NNT功能官能的研究者不尽相同，我们描述了NNT对NSCLC中都细胞内降解还原稳态的诡异制约。在NSCLC中都，NNT活官能显然减轻了大量降解葡萄糖造成了的降解应激化学反应。我们的注意到再进一步暗示了细胞内葡萄糖在白血病再次发生中都的必要官能，指明细胞内功能官能的提升显然是白血病疗程的一个最主要靶点。酵素TPH-1对肾保护起更为重要起着，显然作为疗程CKD的潜在疗程靶点。

原始说是：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.